tese2D

RESUMO DANIELE NUNES PEIXOTO DE ALMEIDA. Evidências da Fosforilação "in vivo" da Proteína de Choque Térmico Hsp26 de Saccharomyces cerevisiae. 01/12/2005 1v. 132p. Doutorado. UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO - BIOQUÍMICA Orientador(es): JOAB TRAJANO SILVA; VANIA MARGARET FLOSI PASCHOALIN Biblioteca Depositaria: Biblioteca do Instituto de Química Email do autor: Palavras - chave: Choque Térmico;Hsp26;Saccharomyces cerevisiae; Área(s) do conhecimento: BIOQUÍMICA Banca examinadora: JOAB TRAJANO SILVA MARIA HELENA MIGUEZ DA ROCHA LEAO NADIA MARIA FRIZZO TRUGO OCTAVIO AUGUSTO CEVA ANTUNES RUSSOLINA BENEDETA ZINGALI VANIA MARGARET FLOSI PASCHOALIN Linha(s) de pesquisa: Proteínas de choque térmico  Estrutura e função das proteínas de choque térmico de Saccharomyces cerevisiae. Agência(s) financiadora(s) do discente ou autor tese/dissertação:   CNPq Idioma(s): Português Dependência administrativa   Federal Resumo tese/dissertação: HSP26 e HSP42 são dois genes de Saccharomyces cerevisiae que codificam proteínas de choque térmico de baixo peso molecular (sHSPs). Hsp26p, a proteína de choque térmico de baixo peso molecular melhor caracterizada em levedura, é um oligômero formado por 24 subunidades com uma organização geral que se assemelha a uma esfera oca que possui atividade co-chaperone. Alterações na estrutura quaternária desta proteína, induzidas pelo aumento de temperatura, podem ser fisiologicamente relevantes na sua atividade chaperone "in vitro". Já foi demonstrado que diversas sHSPs, como as sHSPs de drosófila e mamíferos, são fosforiladas "in vivo". Estudos realizados com células de mamíferos indicaram que a fosforilação das sHSPs pode ser um importante regulador de suas funções, afetando a interação destas proteínas com a actina e, em alguns casos, também a termotolerância. Contudo, a fosforilação da Hsp26p de levedura não tem sido apresentada até o momento. Nós purificamos em nosso laboratório a Hsp26p de levedura, a aparente homogeneidade, como avaliado por SDS-PAGE e, usamos esta preparação para abordar a questão se a proteína de choque térmico de baixo peso molecular de levedura é fosforilada. Nós apresentamos que a Hsp26p purificada de levedura é composta de quatro isoformas de mesma massa molecular e diferentes pontos isoelétricos, e que esta preparação é reconhecida por anticorpos antifosfoserina, implicando, para esta proteína, em um mecanismo de geração de isoformas mediado por fosforilação. Embora proteínas homólogas eucariontes - a Hsp26/27 de drosófila e mamíferos, a Hsp25 de camundongo e a Hsp27 de humanos - podem ser isoladas na forma fosforilada e, algumas delas, desfosforiladas "in vitro" pela calcineurina, nós não pudemos verificar qualquer alteração nas isoformas da Hsp26p de levedura, após este procedimento, sob nossas condições de ensaio. Em um esforço para determinar a influência da fosforilação sobre a atividade chaperone e a oligomerização da Hsp26p de levedura, foi necessário desenhar dois oligonucleotídeos mutagênicos, com alterações nos três resíduos fosforilados na seqüência primária desta proteína (Thr41, Ser207 e Ser210) para alanina (A). A mutagênese foi realizada usando o gene HSP26, retirado do plamídeo multicópia pL19, clonado no vector pGEM®11Zf(+) e "primers" mutagênicos, usando um kit comercial (Promega).

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